支原體是細胞培養(yǎng)物的常見和嚴重污染物。已顯示  30%-87%的細胞培養(yǎng)物感染支原體。許多支原體污染，特別是在連續(xù)細胞系中，生長緩慢，不破壞宿主細胞，但仍能夠影響各種參數，導致結果不可靠或錯誤。這些影響包括代謝、生長、活力、DNA、RNA和蛋白質合成以及形態(tài)的變化。支原體檢測是確保準確研究和可靠生物技術產品的必要質量控制工具。

e-Myco™（版本2.0）產品是一組引物，旨在檢測是否存在可能污染生物材料（如培養(yǎng)細胞）的支原體。常規(guī)

• e-Myco™支原體PCR預混液：PCR條中的藍色沉淀
• 對照DNA：無色透明液體
• 去DNase/RNase水：無色透明液體

No 目錄 組成 25235 25236

• 隨著時間的推移，PCR抑制物質可能在細胞培養(yǎng)基中蓄積。
• 血清超過10 ~ 12%的培養(yǎng)基對PCR等下游應用有抑制作用。而且，細胞培養(yǎng)基中的常規(guī)材料酚紅很可能發(fā)生交叉反應，從而干擾PCR中的信號。
• 這些負面影響可以通過使用Myco-Spin支原體提取試劑盒進行樣品制備來克服。
• 為此，建議純粹從樣本中分離基因組DNA，以確保分析的準確性和重復性。

1. 制備200 μL細胞培養(yǎng)材料，然后轉移至新的1.5 mL微管中
2. 向樣品管中加入200 μL Buffer ML1，20 μL Proteinase K和5 μL RNase ASolution
    

用于檢測支原體的技術涉及在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)樣品，

這需要至少1周才能獲得結果，而通過用該引物組進行PCR，這是基于保守的16S rRNA，在數小時內獲得檢測結果。再者，如果你想知道詳細的物種，你可以從你設計的引物進行PCR和測序。采用的8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)用于消除污染DNA的模板活性。已知8-MOP在波長320-400 nm入射光光光活化后嵌入雙鏈核酸，形成共價鏈間交聯。構建該產品的內部對照以識別假陰性  結果  in  每個  反應。以下  內部  設計對照  in  此類  a  方式   的

e-Myco™

1 支原體PCR預混物

3 不含DNase/RNase

水

< 0.01%熱啟動Taq DNA聚合酶

< 0.01%dATP、dTTP、dGTP、dCTP

< 0.005%支原體引物，內部對照

< 0.001%8-MOP（溶于DMSO）

從豬鼻支原體污染的培養(yǎng)人細胞中提取的基因組DNA < 0.01%。

無模板對照

< 去DNase/RNase水

48T 8T

25 μL x 3T 25 μL x 1T

并通過倒置或移液充分混合。

3. 將裂解物在56 ℃（預熱的加熱塊或水?。┫路跤?0 min。
4. *裂解后，向上層樣品管中加入200 μL Buffer ML2，充分混勻。
5. 向裂解液中加入200 μL無水乙醇，輕輕顛倒5-6次或吸液混勻。請勿渦旋?；旌虾?，短暫離心1.5 mL試管，除去蓋子內部的液滴。

樣本引物對用于擴增內部對照和靶DNA，通過大小進行區(qū)分。e-Myco™支原體PCR檢測試劑盒（版本2.0）包含PCR的所有組分，模板除外：i-StarTaqTM DNA聚合酶、dNTP、10x緩沖液、引物、8-MOP和支原體部分基因擴增的內部對照。因此，您可以添加模板并進行PCR反應。

• 預混型：該e-Myco™支原體PCR檢測試劑盒（版本2.0）包含PCR反應的所有組分。您只需添加模板DNA或樣本。
• 廣義種屬檢測：您可以檢測五種常見的細胞培養(yǎng)-感染支原體以及其他各種支原體
• 菌種確定：您可以通過對擴增的PCR產物進行測序來確定支原體的菌種。
• 內部對照品：產品中嵌入的外源性內部陽性對照品可防止可能由錯誤PCR檢測引起的誤判。
• 消除殘留污染系統(tǒng)：8-MOP溶液可防止PCR產物的殘留污染。
• 僅供研究使用，不用于診斷程序。

e-Myco™支原體PCR檢測試劑盒（版本2.0）的開發(fā)、設計和銷售僅供研究使用。預期不用于人類或動物疾病診斷。不得在人或動物體內或體外使用。在將其用于其他目的之前，用戶必須按照適用法律、指令和法規(guī)確認系統(tǒng)。

• 移液器和移液器吸頭（氣溶膠屏障）•Myco-Spin支原體提取試劑盒
• 熱循環(huán)儀 •渦旋混合器
• 一次性手套 •加熱塊

• 保存條件：接收后-22~-18 ℃保存。
• 有效期：e-Myco™支原體PCR檢測試劑盒（版本2.0）在適當的儲存條件下可儲存長達12個月，性能和質量均未降低。產品包裝盒上標有失效日期。

6. 在不潤濕邊緣的情況下，小心將全部裂解物轉移至旋轉柱（2 mL收集管中），蓋上蓋子，并以13,000 rpm離心1 min。棄去濾液，將旋轉柱置于2 mL收集管中（重復使用）。
7. 向色譜柱中加入700 μL緩沖液MWA，并以13,000 rpm離心1 min。
8. 在不潤濕邊緣的情況下，向色譜柱中加入700 μL緩沖液MWB，并以13,000 rpm離心1 min。棄去流穿液，將色譜柱置于2.0 mL采集管中（重復使用），然后再次離心1 min以干燥膜。*丟棄穿柱管和收集管。
9. 將旋轉柱置于新的1.5 mL試管（未提供）中，并將50 μL緩沖液ME直接置于膜上。在室溫下孵育1 min，然后以13,000 rpm離心1 min以洗脫。

1. 在1.5 mL試管中制備供試細胞培養(yǎng)物的細胞懸液。然后用一般計數方法計數細胞數。每次檢測至少需要5 x 104個細胞。

注：強支原體感染只需10 ~ 100個細胞即可檢出，而弱感染需要5000 ~ 50000個細胞以上的細胞。您可以根據您懷疑的感染率稀釋模板。我們建議您在制備直接上清液的系列稀釋液后進行PCR反應，以獲得結果。

2. 將計數的細胞（超過5 × 104個細胞）轉移至1.5 mL試管中。在微量離心機中旋轉10-15秒。小心倒出上清液。
3. 將細胞重懸于1 mL無菌PBS或DPBS溶液中進行清洗。
4. 在微量離心機中旋轉10-15秒。小心倒出上清液。

[選項]再次重復該清洗步驟。

5. 將細胞沉淀重懸于100 μL無菌PBS或DPBS溶液中。

注：如果您希望獲得結果，使用PBS溶液優(yōu)于Tris(10 mM，pH 8.5)、TE(10 mM Tris，0.1 mM EDTA)或高壓滅菌DW。

6. 在95 ℃下加熱樣品10 min，渦旋5-10 s。然后，使用臺式離心機（室溫）以13,000 rpm離心2 min。
7. 將一等份加熱上清液轉移至新試管中。該上清液將用作PCR的模板。